Métodos de Separación, Purificación, Identificación y Cuantificación de Biomoléculas

Métodos de Separación, Purificación, Identificación y 

Cuantificación de Biomoléculas

DESNATURALIZACION

Cuando la proteína no ha sufrido ningún cambio se dice que presenta una "Estructura nativa". Se llama desnaturalización de las proteínas a la pérdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptídica reducida a un polímero estadístico sin ninguna estructura tridimensional fija.

La Desnaturalizacion es un cambio estructural de las proteinas o acidos nucleicos, donde se pierde su estructura nativa y de esta forma su funcionamiento, a veces tambien pierden sus propiedades fisicoquimicas 

BIOMOLECULAS + AFECTACION DEL AMBIENTE = DESNATURALIZACION

Las proteínas se desnaturalizan cuando pierden su estructura tridimensional "Conformacion Espacial" y su caracteristico plegamiento estructural. 

La desnaturalización provoca diversos efectos en la proteína:

cambios en las propiedades hidrodinámicas de la proteína: aumenta la viscosidad y disminuye el coeficiente de difusión

acompañado a una drástica disminución de su solubilidad, ya que los residuos hidrofóbicos del interior aparecen en la superficie tenendio tambien pérdida de las propiedades biológicas

Una proteína desnaturalizada cuenta únicamente con su estructura primaria. Por este motivo, en muchos casos, la desnaturalización es reversible ya que es la estructura primaria contiene la información necesaria y suficiente para adoptar niveles superiores de estructuración. El proceso mediante el cual la proteína desnaturalizada recupera su estructura nativa se llama Renaturalización. 

Esta propiedad es de gran utilidad durante los procesos de aislamiento y purificación de proteínas, ya que no todas la proteínas reaccionan de igual forma ante un cambio en el medio donde se encuentra disuelta. 

En algunos casos, la desnaturalización conduce a la pérdida total de la solubilidad, con lo que la proteína precipita. 

La formación de agregados fuertemente hidrofóbicos impide su renaturalización, y hacen que el proceso sea irreversible.

La desnaturalizacion de acidos nucleicos cono ADN por altas temperaturas produce una separacion en la doble helice, que ocurre porque los enlaces de puentes de hidrogeno se rompen. Esto ocurre durante la reaccion en cadena de las polimerasas. Las cadenas de Acido Nucleico se vuelven a unir ( renaturalizarse) una vez que las condiciones "normales" se restauren. 

Si las condiciones se restauran rapidamente. Las cadenas pueden alinearse correctamente. 

Los agentes que provocan la desnaturalización de una proteína se llaman agentes desnaturalizantes. Se distinguen agentes físicos (calor) y químicos (detergentes, disolventes orgánicos, pH, fuerza iónica). Como en algunos casos el fenómeno de la desnaturalización es reversible, es posible precipitar proteínas de manera selectiva mediante cambios en:

FACTORES DESNATURALIZANTES

1.- POLARIDAD DEL DISOLVENTE

EFECTO DE LA POLARIDAD DEL DISOLVENTE SOBRE LA ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS

La polaridad del disolvente disminuye cuando se le añaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona. Con ello disminuye el grado de hidratación de los grupos iónicos superficiales de la molécula proteica, provocando la agregación y precipitación. Los disolventes orgánicos interaccionan con el interior hidrofóbico de las proteínas y desorganizan la estructura terciaria, provocando su desnaturalización y precipitación. La acción de los detergentes es similar a la de los disolventes orgánicos.

2.- FUERZA IONICA

EFECTO DE LA FUERZA IÓNICA SOBRE LA ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS

Un aumento de la fuerza iónica del medio (por adición de sulfato de amonio, urea o hidrocloruro de guanidinio, por ejemplo) también provoca una disminución en el grado de hidratación de los grupos iónicos superficiales de la proteína, ya que estos solutos:

(1) compiten por el agua 

(2) rompen los puentes de hidrógeno o las interacciones electrostáticas, de forma que las moléculas proteicas se agregan y precipitan.

En muchos casos, la precipitación provocada por el aumento de la fuerza iónica es reversible. Mediante una simple diálisis se puede eliminar el exceso de soluto y recuperar tanto la estructura como la función original. A veces es una disminución en la fuerza iónica la que provoca la precipitación. Así, las proteínas que se disuelven en medios salinos pueden desnaturalizarse al dializarlas frente a agua destilada, y se renaturalizan cuando se restaura la fuerza iónica original.

3.- Ph

EFECTO DEL pH SOBRE LA ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS

Los iones H+ y OH- del agua provocan efectos parecidos, pero además de afectar a la envoltura acuosa de las proteínas también afectan a la carga eléctrica de los grupos ácidos y básicos de las cadenas laterales de los aminoácidos. Esta alteración de la carga superficial de las proteínas elimina las interacciones electrostáticas que estabilizan la estructura terciaria y a menudo provoca su precipitación. La solubilidad de una proteína es mínima en su punto isoeléctrico, ya que su carga neta es cero y desaparece cualquier fuerza de repulsión electrostática que pudiera dificultar la formación de agregados.

4.- TEMPERATURA

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ESTRUCTURA DE LAS PROTEÍNAS

Cuando la temperatura es elevada aumenta la energía cinética de las moléculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las proteínas, y se desnaturalizan. Asímismo, un aumento de la temperatura destruye las interacciones débiles y desorganiza la estructura de la proteína, de forma que el interior hidrofóbico interacciona con el medio acuoso y se produce la agregación y precipitación de la proteína desnaturalizada.